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綠色熒光素標(biāo)記血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)中,如何確定標(biāo)記的效率?

2025-01-12 [22]
在綠色熒光素標(biāo)記血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)中,可通過以下幾種方法確定標(biāo)記效率:

熒光光譜法


  • 原理:利用熒光分光光度計(jì)測(cè)量標(biāo)記前后血紅蛋白溶液的熒光強(qiáng)度。由于熒光素標(biāo)記后會(huì)使血紅蛋白具有特定的熒光發(fā)射峰,通過比較標(biāo)記前后在相應(yīng)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度變化,可計(jì)算出標(biāo)記效率。

  • 步驟:首先,用熒光分光光度計(jì)對(duì)未標(biāo)記的血紅蛋白溶液進(jìn)行掃描,確定其本底熒光強(qiáng)度。然后,對(duì)標(biāo)記后的血紅蛋白溶液在熒光素的特征發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)量。標(biāo)記效率可通過公式計(jì)算:標(biāo)記效率 =(標(biāo)記后熒光強(qiáng)度 - 未標(biāo)記時(shí)本底熒光強(qiáng)度)/ 理論最大熒光強(qiáng)度 ×100%。

凝膠電泳法


  • 原理:根據(jù)標(biāo)記與未標(biāo)記血紅蛋白在凝膠電泳中的遷移率差異來判斷標(biāo)記情況。標(biāo)記后的血紅蛋白由于結(jié)合了熒光素,分子量會(huì)增加,在凝膠中的遷移速度會(huì)變慢,通過比較電泳條帶的位置和亮度來確定標(biāo)記效率。

  • 步驟:將未標(biāo)記和標(biāo)記后的血紅蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后,用熒光成像儀或紫外燈觀察凝膠中的條帶。如果標(biāo)記效率高,標(biāo)記后的血紅蛋白條帶會(huì)滯后于未標(biāo)記的血紅蛋白條帶,且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。通過對(duì)條帶的灰度值或熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析,可計(jì)算出標(biāo)記效率。

流式細(xì)胞術(shù)


  • 原理:當(dāng)細(xì)胞或顆粒被熒光素標(biāo)記后,流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)到其發(fā)出的熒光信號(hào)。通過分析標(biāo)記后細(xì)胞或顆粒的熒光強(qiáng)度分布,與已知標(biāo)準(zhǔn)或未標(biāo)記對(duì)照進(jìn)行比較,從而確定標(biāo)記效率。

  • 步驟:將標(biāo)記后的血紅蛋白與適當(dāng)?shù)募?xì)胞或微球混合,使血紅蛋白結(jié)合到細(xì)胞或微球表面。然后將樣品加入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè),設(shè)置合適的熒光通道和閾值,收集熒光信號(hào)。根據(jù)熒光陽性細(xì)胞或微球的比例以及平均熒光強(qiáng)度,與未標(biāo)記對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算出標(biāo)記效率。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法


  • 原理:利用抗原 - 抗體特異性結(jié)合的原理,將標(biāo)記有熒光素的血紅蛋白作為抗原,與特異性抗體結(jié)合,再通過酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合,最后通過酶催化底物顯色,根據(jù)顯色程度來間接反映標(biāo)記效率。

  • 步驟:將未標(biāo)記和標(biāo)記后的血紅蛋白分別包被在酶標(biāo)板的不同孔中,加入特異性抗體孵育,洗滌后加入酶標(biāo)二抗繼續(xù)孵育,最后加入底物顯色。通過酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在特定波長(zhǎng)下的吸光度值,標(biāo)記效率可根據(jù)標(biāo)記后與未標(biāo)記樣品的吸光度比值來計(jì)算。

放射性核素標(biāo)記法


  • 原理:在標(biāo)記反應(yīng)中加入一定量的放射性核素標(biāo)記的熒光素,通過檢測(cè)標(biāo)記后血紅蛋白的放射性強(qiáng)度,結(jié)合已知加入的放射性核素總量,計(jì)算出標(biāo)記效率。

  • 步驟:在標(biāo)記反應(yīng)體系中加入放射性核素標(biāo)記的熒光素,如用放射性碘(12?I)標(biāo)記的 FITC。標(biāo)記反應(yīng)完成后,用放射性檢測(cè)儀測(cè)量標(biāo)記后血紅蛋白的放射性強(qiáng)度。根據(jù)加入的放射性核素總量和實(shí)際檢測(cè)到的放射性強(qiáng)度,通過公式計(jì)算標(biāo)記效率:標(biāo)記效率 =(標(biāo)記后樣品放射性強(qiáng)度 / 加入的放射性核素總放射性強(qiáng)度)×100%。

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