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熒光素標(biāo)記血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)步驟

2025-01-10 [22]
以下是一般的熒光素標(biāo)記血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)步驟:

試劑和材料準(zhǔn)備


  • 血紅蛋白溶液:可以從血液中分離提取血紅蛋白,也可購(gòu)買商品化的血紅蛋白產(chǎn)品,用合適的緩沖液將其溶解并調(diào)整至合適的濃度,一般濃度不小于 0.5mg/mL。

  • 熒光素:如異硫氰酸熒光素(FITC),使用無水 DMSO 配制 10mM 的染料溶液,剩余染料溶液可在 - 20℃分裝保存 1 個(gè)月。如果是水溶解,染料有易被水解的性質(zhì),建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

  • 緩沖液:如 pH 8-9 的碳酸鹽緩沖液或 pH 8.2 的磷酸鹽緩沖液。

標(biāo)記反應(yīng)


  • 取一定量的血紅蛋白溶液置于合適的容器中,如比色管或離心管。

  • 加入適量的緩沖液,使反應(yīng)體系處于適宜的 pH 和離子強(qiáng)度環(huán)境。

  • 按照一定的摩爾比緩慢滴加熒光素溶液,染料與蛋白的摩爾比通常在 5:1-20:1,邊滴加邊攪拌或輕輕振蕩,使反應(yīng)充分混合。

  • 將反應(yīng)容器置于一定的溫度條件下孵育,如 4℃反應(yīng) 12 小時(shí)或室溫下反應(yīng) 2 小時(shí)等。

純化與分離


  • 反應(yīng)結(jié)束后,需要通過透析或者凝膠過濾等方法除去未反應(yīng)的熒光素。透析時(shí),將反應(yīng)后的溶液裝入透析袋中,在大量的緩沖液中透析數(shù)小時(shí)至過夜,期間更換緩沖液數(shù)次,以去除未結(jié)合的熒光素。凝膠過濾可以使用葡聚糖凝膠等填料,將反應(yīng)混合物上樣到凝膠柱上,用緩沖液洗脫,收集標(biāo)記的血紅蛋白峰。

檢測(cè)與鑒定


  • 熒光顯微鏡觀察:取少量標(biāo)記后的血紅蛋白溶液,滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察,選擇與熒光素激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)匹配的濾光片,看是否有明顯的熒光信號(hào),并且觀察熒光的分布情況,判斷標(biāo)記是否成功。

  • 蛋白電泳實(shí)驗(yàn):進(jìn)行蛋白電泳,標(biāo)記后蛋白本身分子量會(huì)增大,若蛋白存在微小向上拖帶可以證明標(biāo)記成功。如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發(fā)生降解。

  • 分光光度計(jì)測(cè)定:使用分光光度計(jì)測(cè)定熒光素和血紅蛋白的比值(F/P),F(xiàn)/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質(zhì)量,一般要求 F/P 的克分子比值為 1~3。過高時(shí),非特異性染色增強(qiáng);過低時(shí),熒光很弱,標(biāo)記效率低。

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