FITC - 環(huán)糊精的制備過程一般如下:
環(huán)糊精的選擇與預處理:根據(jù)具體需求選擇合適的環(huán)糊精類型,如 α-、β-、γ- 環(huán)糊精等,其中 β- 環(huán)糊精應用較為廣泛。若環(huán)糊精本身不含有可與 FITC 反應的活性基團,需先對其進行化學修飾,引入如氨基等活性基團。例如,可通過將環(huán)糊精與氨基修飾劑(如氨基乙基化試劑)反應,在環(huán)糊精分子上引入氨基.
FITC 溶液的配制:通常將 FITC 溶解在適當?shù)娜軇┲?,如無水二甲基亞砜(DMSO)或磷酸鹽緩沖液(PBS)等,配制成一定濃度的溶液,一般濃度為 1mg/ml 左右,且需現(xiàn)用現(xiàn)配,以防止 FITC 分解失效.
反應條件的確定:將含有活性基團的環(huán)糊精溶液與 FITC 溶液混合,反應一般在弱堿性條件下進行,pH 值通??刂圃?8-9 左右,如 pH 8.5 時反應效率和穩(wěn)定性較好。同時,反應可在室溫或較低溫度下進行,如 4℃左右,以避免溫度過高導致副反應增加.
反應過程:在避光條件下,將 FITC 溶液緩慢地逐滴加入到環(huán)糊精溶液中,邊加邊輕輕攪拌,使二者充分混合均勻,然后在選定的溫度和 pH 條件下進行孵育反應。反應時間根據(jù)具體情況而定,一般需要數(shù)小時至數(shù)十小時不等,例如 8-12 小時,也可通過設置不同的時間梯度進行預實驗,以確定最佳反應時間.
反應終止與純化:反應結束后,需加入適量的終止劑終止反應,如氯化銨等,使反應體系中的未反應 FITC 失活。然后可采用透析法、凝膠過濾色譜法、高效液相色譜法等對標記產(chǎn)物進行純化,以去除未反應的 FITC、環(huán)糊精以及其他雜質,得到高純度的 FITC - 環(huán)糊精.
產(chǎn)物鑒定與檢測:使用熒光光譜儀對純化后的 FITC - 環(huán)糊精產(chǎn)物進行熒光檢測,激發(fā)波長一般為 490 - 495nm,發(fā)射波長為 515 - 525nm,觀察其熒光強度和光譜特征是否符合預期,以確定標記是否成功以及標記效率的高低 。此外,還可結合其他分析方法,如高效液相色譜(HPLC)、質譜(MS)等對標記產(chǎn)物的純度、結構等進行進一步的鑒定和分析,以確保獲得高質量的 FITC - 環(huán)糊精標記產(chǎn)物.
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